Inhibición del crecimiento tumoral y metástasis con Nanopartículas auto-terapéuticas de Oro
RESUMEN
Aunque las aplicaciones biomédicas de la nanotecnología, que generalmente involucran nanopartículas funcionalizadas, han dado pasos importantes, la caracterización biológica de las nanopartículas no modificadas sigue siendo poco investigada. Aquí demostramos que las nanopartículas de oro (AuNP) inhiben la proliferación de células cancerosas de una manera dependiente del tamaño y la concentración al anular la señalización de MAPK. Además, estos AuNP invierten la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) en las células cancerosas al reducir la secreción de una serie de proteínas involucradas en la EMT, la E-Cadherina reguladora y la Caracol, N-Cadherina y Vimentina reguladoras negativas. La inhibición de la señalización de MAPK y la reversión de EMT con el tratamiento con AuNP inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis en dos modelos ortotópicos separados de cáncer de ovario. Los análisis de Western blot de tejidos tumorales revelan una regulación positiva de E-Cadherina y una regulación negativa de Snail y fosfo-MAPK, confirmando la reversión de EMT e inhibición de la señalización de MAPK tras el tratamiento con AuNP. La capacidad de una sola nanopartícula autoterapéutica para derogar las cascadas de señalización de múltiples factores de crecimiento es distintiva y pretende posibles aplicaciones médicas como agente antitumoral y antimetastásico potencial.
Los principales esfuerzos en nanotecnología biomédica se han concentrado en el área de entrega de medicamentos y aplicaciones de biosensores. Aunque las propiedades fisicoquímicas y optoelectrónicas dependientes del tamaño y la forma de las nanopartículas inorgánicas se han estudiado en detalle ( 1 ), sus propiedades biológicas aún no se han dilucidado. Las nanopartículas de oro (AuNP), en particular, han atraído una gran atención en diversas aplicaciones biomédicas porque son biocompatibles, fáciles de sintetizar, caracterizar y modificar la superficie debido a la gran capacidad de AuNP para unirse a –SH- y –NH 2 - que contienen moléculas ( 2 ). Por lo tanto, las moléculas biológicas, particularmente las proteínas, pueden servir como sustratos importantes en la unión a AuNP a través de residuos de cisteína y lisina. La unión preferencial de proteínas ricas en cisteína / lisina a AuNP puede alterar su estructura y funciones biológicas, permitiendo que las AuNP sean explotadas como agente terapéutico. Recientemente demostramos que los AuNP al unirse a HB – GF (factores de crecimiento de unión a heparina) como el GF 165 endotelial vascular (VEGF165) y el GF de fibroblastos básicos (bFGF) inhibieron su función debido al despliegue de la estructura de la proteína ( 3 ). Dado que los HB-GF son críticamente importantes para la angiogénesis y la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT), un mecanismo que confiere potencial metastásico a las células tumorales, los AuNP pueden encontrar amplias aplicaciones como agentes terapéuticos en los trastornos dependientes de la angiogénesis y en la prevención del crecimiento tumoral y la metástasis en el cáncer (4).
El cáncer epitelial de ovario (COE) es una de las neoplasias ginecológicas más letales ( 5 ). A pesar de la reducción quirúrgica óptima y el régimen quimioterapéutico cuidadosamente diseñado, la recaída es casi inevitable con un fenotipo más resistente a los fármacos y una diseminación metastásica ( 6 ). La EMT es uno de los principales mecanismos subyacentes al desarrollo de metástasis de cáncer, que induce propiedades similares a las del tallo y confiere resistencia a los medicamentos a las células tumorales ( 7 , 8 ). Por lo tanto, revertir el proceso de EMT podría ser un enfoque terapéutico único para sensibilizar las células resistentes a los medicamentos a la quimioterapia e inhibir la metástasis. La represión de E-Cadherin (E-Cad) es el sello distintivo de EMT y ocurre a través de represores transcripcionales como Vimentin, Snail, Slug, Twist, etc. ( 8 - 10 ). La baja regulación de la expresión de E-Cad por sus represores transcripcionales a través de varios mecanismos compensatorios e independientes plantea un desafío para la terapia anti-EMT ( 11 - 13 ). Dado que las AuNP pueden inhibir la función de una multitud de HB – GF responsables de la EMT ( 3 , 14 , 15 ), potencialmente puede actuar como una molécula multifuncional para revertir la plasticidad epitelial, inhibiendo así el crecimiento tumoral y la metástasis. Varios GF inflamatorios que contienen el dominio HB son fundamentales para regular la EMT, como VEGF165, HB-EGF, bFGF, TGF-β, TNF-α, etc., que se sobreexpresan en el cáncer de ovario y otros tumores sólidos ( 16 ). En muestras clínicas, los altos niveles de estos HB-GF se correlacionan con la etapa avanzada de la enfermedad, el aumento de la metástasis y la supervivencia deficiente ( 17 ). Por lo tanto, el cáncer de ovario representa un modelo importante para probar la propiedad auto-terapéutica anti-EMT y antitumoral de AuNP.
RESULTADOS
Las Nanopartículas de Oro (AuNP) inhiben la proliferación de células de cáncer de ovario de una manera dependiente del tamaño.
Los AuNP se utilizaron para todos los estudios y se denominan nanopartículas no modificadas en este documento. Para determinar una relación entre el tamaño y la función biológica de las nanopartículas, utilizamos AuNP de cuatro tamaños diferentes (alrededor de 5, 20, 50 o 100 nm) y los caracterizamos por microscopía electrónica de transmisión (TEM), dispersión dinámica de luz (DLS) y mediciones de potencial zeta ( Figuras S1 y S2 ). A continuación, buscamos determinar el efecto de estos AuNP en la proliferación de tres líneas celulares diferentes de cáncer de ovario (células A2780, OVCAR5 y SKOV3-ip) y compararlas con el epitelio normal de la superficie ovárica (OSE) células ( 18 ). Nuestros hallazgos demostraron que tanto el tamaño como la concentración de AuNP desempeñan un papel fundamental en la inhibición de la proliferación de células de cáncer de ovario (según lo determinado por la incorporación de 3 [H] -Timidina), de una manera dependiente del tiempo ( Figura 1 y Figura S3 ) . Mientras que las AuNP de 20 nm exhibieron la mayor eficacia a las 72 h para inhibir la proliferación de las células SKOV3-ip, las AuNP de 5 nm mostraron solo una inhibición modesta, mientras que no se observó inhibición con AuNP de 50 y 100 nm de tamaño ( Figura 1 ). Además, la proliferación de células OSE normales no se vio afectada ( Figura S4 A ). Los AuNP exhibieron efectos similares dependientes del tamaño y la concentración en las células A2780 y OVCAR5 ( Figura S3 ) Estos resultados demuestran claramente que el efecto inhibidor de AuNP depende del tamaño de la superficie, con AuNP de 20 nm que muestra la mayor eficacia. Dado que nuestra hipótesis de trabajo es que los GN secretados por las células malignas son inhibidos por AuNP, la mayoría de nuestros experimentos se realizan en condiciones de hambre. Sin embargo, es importante probar la eficacia de AuNP en varios niveles séricos. Como se muestra en la Fig. S4 B , los AuNP de 20 nm (20 µg / ml) inhiben la proliferación de células A2780 en presencia de diferentes concentraciones de suero. Estos resultados ilustran claramente que las interacciones entre AuNPs y proteínas es un proceso muy dinámico y complejo que merece una mayor investigación.
El tratamiento con AuNP altera el perfil de citoquinas en las células de cáncer de ovario.
Para comprender mejor el mecanismo de la inhibición de la activación de MAPK mediada por AuNP, queríamos determinar si el tratamiento con AuNP de 20 nm alteró el perfil de citocinas en los lisados celulares y los medios condicionados de las células de cáncer de ovario ( Fig. 2 A – D ). El tratamiento con AuNP redujo sustancialmente los niveles de hepatocitos GF (HGF), activador de plasminógeno de uroquinasa (uPA) y niveles de bFGF, mientras que el nivel de Serpin E1 aumentó en el lisado de las células A2780. Sin embargo, en los medios condicionados de células A2780 tratadas con AuNP, la transformación de GF-β (TGF-β1), la metaloproteinasa de matriz 8 (MMP 8), la proteína del gen 14 inducible por TNF (TSG-14) y los niveles de uPA disminuyeron sustancialmente, mientras que el nivel de Serpin 1 aumentó ( Fig. 2 A y C ) Mientras que los niveles de bFGF, interleucina-8 (IL-8) y uPA disminuyeron significativamente en el lisado de las células SKOV3-ip después del tratamiento con AuNP, el nivel de Serpin E1 aumentó tanto en el lisado como en los medios condicionados. De manera similar, la dipeptidil peptidasa 4 (DDP4), IL-8, PDGF y uPA disminuyeron significativamente en los medios condicionados de las células SKOV3-ip tratadas con AuNP, y los niveles de Serpin E1 y trombospondina-1 (THBS-1) aumentaron ( Fig. .2 B y D ). Dado que se sabe que todas estas proteínas activan la vía MAPK en las células cancerosas a través de diversos mecanismos, la regulación negativa de estas proteínas tras el tratamiento con AuNP respalda aún más el efecto antiproliferativo de AuNP debido a la anulación de la señalización de MAPK.
Las AuNP inhiben el crecimiento tumoral in vivo.
Dado que los AuNP inhibieron la proliferación de las células de cáncer de ovario y demostraron la función anti-EMT in vitro, a continuación buscamos determinar sus propiedades terapéuticas in vivo utilizando dos modelos ortotópicos de cáncer de ovario. En el primer modelo, donde el crecimiento tumoral se localizaba principalmente en el ovario, implantamos quirúrgicamente A2780-luciferasa (luc) intrabursalmente en los ovarios y monitoreamos el crecimiento tumoral de manera no invasiva usando bioluminiscencia sobre tiempo ( 30 ). En el segundo modelo, implantamos quirúrgicamente células SKOV3-ip-luc intrabursalmente en los ovarios y monitoreamos el crecimiento tumoral y la metástasis de manera no invasiva como se indicó anteriormente ( 31 ). Después de 3 semanas de 3 días / semana de inyección ip de AuNP se recogieron y midieron tumores y nódulos metastásicos (ver Fig. S8 A para una imagen representativa). Se observó una reducción sustancial en la bioluminiscencia en tejidos tratados con AuNP ( Fig. 3 A ). Los tejidos tratados con 200 μg o 400 μg de AuNP de 20 nm tuvieron una reducción de tres veces la masa tumoral, mientras que el tratamiento de 100 μg tuvo una disminución de ∼1.5 veces en comparación con los controles tratados con PBS ( Fig. 3 B ). Del mismo modo, el análisis del contenido de oro demostró que los tejidos tratados con 200 μg y 400 μg tenían una diferencia de tres a cuatro veces en la absorción de AuNP en los tumores en comparación con los tejidos tratados con 100 μg de AuNP de 20 nm ( Fig. 3 C) También se observó una absorción significativa en el hígado, con una absorción marginal en los pulmones y los riñones ( Fig. S8 D ). Sin embargo, el análisis histológico de los órganos no reveló ningún signo de inflamación o toxicidad en los grupos tratados con AuNP ( Fig. S8 E ). La ausencia de toxicidad potencial de AuNP también se informó anteriormente ( 32 ). El análisis TEM adicional confirmó la captación pasiva de AuNP en los tumores ( Fig. 3 D ). Para corroborar nuestros datos in vitro, examinamos el efecto de AuNP en la proliferación celular in vivo por tinción con Ki67 de las muestras tumorales ( Fig. 3 E y G) El tratamiento con 200 μg de AuNP de 20 nm mostró el efecto más alto, con una disminución de ~ 70% en las células positivas para Ki67 en comparación con el grupo tratado con PBS (NT; Fig. 3 E ). Los tejidos tratados con 400 μg mostraron una reducción del 55% en las células positivas para Ki67, mientras que el grupo tratado con 100 μg mostró una reducción del 40%. El tratamiento con AuNP también reveló una disminución sustancial en el número de vasos sanguíneos según lo determinado por la tinción de CD31 ( Fig. 3 F y G ), consistente con el efecto inhibidor de AuNP hacia HB-GF. A diferencia de los resultados in vitro, también se notó una inducción significativa de apoptosis en los tejidos tumorales mediante el ensayo TUNEL en el grupo tratado con AuNP en comparación con el control ( Fig. S9 ).
El tratamiento con AuNP inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis in vivo al revertir la EMT de las células tumorales.
Dado que los AuNP exhibieron potencial anti-EMT in vitro, a continuación buscamos determinar su eficacia anti-EMT in vivo reflejada por la formación de nódulos metastásicos. Dado que 200 μg / tejido demostraron la mayor eficacia terapéutica para inhibir el crecimiento tumoral en el primer modelo, decidimos seleccionar esta dosis para probar la propiedad anti-metastásica de AuNP en el modelo SKOV3-ip. El tratamiento con nanopartículas (20 nm AuNP, 200 μg / tejido / día) resultó en una disminución drástica de la bioluminiscencia en el transcurso del estudio ( Fig. 4 A ). Los tumores tratados con AuNP mostraron una disminución sustancial en la masa tumoral ( Fig. 4 B ) en comparación con los tumores tratados con simulación (NT). De manera similar, se observó una disminución sustancial en la metástasis peritoneal y una reducción en el número de formación de nódulos metastásicos en tumores tratados con AuNP en comparación con tumores NT ( Fig. 4 C ). También se observó una inducción significativa de apoptosis en tejidos tumorales del grupo tratado con AuNP en comparación con el control ( Fig. S9 ). Además, los análisis de transferencia Western de las muestras tumorales mostraron una disminución en Snail y un aumento notable en E-Cad con el tratamiento con nanopartículas ( Fig. 4 D ). También se observó una disminución notable en la activación de p42 / 44, corroborando nuestros datos in vitro. Todos estos hallazgos respaldan la función auto-terapéutica anti-EMT de AuNP en la inhibición del crecimiento tumoral y la metástasis.
DISCUSIÓN
El cáncer de ovario es una de las principales causas de mortalidad entre las mujeres ( 5 ). La extirpación quirúrgica es generalmente la única opción; aun así, solo el 15-20% son aptos para la cirugía debido al diagnóstico tardío ( 33 ). Además, a pesar de la reducción quirúrgica óptima y los regímenes quimioterapéuticos meticulosamente diseñados, la recurrencia de la enfermedad con fenotipo resistente a fármacos y diseminación metastásica es un evento común ( 6 , 33 ). Se considera que la EMT (transición epitelio-mesénquima) es un mecanismo clave que confiere propiedades de tipo tallo a las células de cáncer epitelial, lo que lleva a metástasis y fenotipo resistente a los medicamentos ( 9 , 16 ). Por lo tanto, revertir el proceso de EMT podría ser un enfoque terapéutico único para sensibilizar las células resistentes a los medicamentos a la quimioterapia e inhibir la metástasis. Sin embargo, la baja regulación de la expresión de E-Cad por sus represores transcripcionales como Vimentin, Snail, Slug, Twist, etc., a través de varios mecanismos redundantes e independientes, plantea un desafío para la terapia anti-EMT ( 11 - 13 ). Dado que los AuNP pueden inhibir la función de una multitud de HB-GF responsables de EMT ( 3 , 15 ), potencialmente puede actuar como una molécula multifuncional para revertir la plasticidad epitelial, inhibiendo así el crecimiento tumoral y la metástasis.
En este estudio, demostramos que las nanopartículas de Oro (AuNP) exhiben propiedades antitumorales y anti-EMT únicas que inhiben el crecimiento tumoral y la metástasis en dos modelos ortotópicos de cáncer de ovario. La inhibición de la proliferación celular in vitro se debe principalmente a la abrogación de la señalización de MAPK (proteína quinasas activadas por mitógenos), iniciada por HB-GF secretados por las células cancerosas ( Fig. 1 ). Sin embargo, la proliferación de células OSE normales no se ve afectada, presumiblemente porque estas células tienen una capacidad disminuida para secretar dichos GF. La reducción de la fosforilación de p42 / 44 se debe probablemente a la unión de AuNPs e inhibiendo la función de HB-GF como se informó anteriormente ( 3 , 20 , 21 ). Dado que la activación de MAPK es una vía central en la proliferación de células tumorales, los AuNP pueden encontrar una aplicación útil para abrogar esta vía para inhibir el crecimiento tumoral ( 34 ). Curiosamente, el efecto inhibitorio de AuNPs se correlaciona con su patrón de absorción intracelular ( Fig. 1 F ). Estos datos sugieren que, además de inhibir la función de los HB-GF secretados, los AuNP internalizados también pueden alterar los procesos intracelulares de las células tumorales, lo que lleva a la anulación de la cascada de señalización de MAPK. Para comprender mejor los efectos biológicos de las AuNP internalizadas, investigamos el perfil de citoquinas en los lisados celulares y los medios condicionados de las células cancerosas después del tratamiento con AuNP.
El tratamiento con AuNP alteró el perfil de citoquinas en los medios condicionados y los lisados celulares de las células de cáncer de ovario ( Fig. 2 A – D ). Este tratamiento redujo los niveles de varias citocinas, como HGF, TGF-β, bFGF, PDGF, uPA, etc., responsables de la activación de MAPK y EMT en células cancerosas ( 35 - 38 ). Por ejemplo, se ha informado que el receptor de uPA (uPAR) se sobreexpresa en los carcinomas HEp3, lo que promueve su rápido crecimiento e inicia la cascada de señalización que desencadena la fosforilación de p42 / 44 ( 35 , 37 ). Esta activación promueve que uPA se una a uPAR, creando así un ciclo de retroalimentación positiva. Asimismo, se observó un aumento dependiente de la dosis en Serpin E1, que inhibe la uPA. Además, Serpin E1 también puede tener un papel en la regulación de la angiogénesis y el crecimiento tumoral ( 36 ). También es evidente a partir de la Fig. 2 E y F que uPA, bFGF, PDGF y HGF también estaban transcripcionalmente regulados por AuNP de 20 nm. Sin embargo, TGF-β y Serpin E1 exhibieron efectos opuestos y el nivel transcripcional, lo que sugiere otro nivel de complejidad en la regulación de estas proteínas. Cabe señalar además que muchos de los GF están autorregulados, de modo que la reducción en su nivel de proteína o función de proteína provoca una reducción en su inducción de ARNm ( 39 , 40 ). Juntos, los resultados obtenidos de qRT-PCR y la matriz de citocinas indican que el tratamiento con AuNP en las líneas celulares de cáncer de ovario modula la expresión del crecimiento tanto a nivel transcripcional como translacional. Dado que las proteínas discutidas anteriormente son colectivamente conocidas por inducir EMT ( 19 , 25 ,41 ), estos resultados sugieren una posible función anti-EMT de AuNPs.
La función anti-EMT de AuNP se apoyó aún más a través de la expresión mejorada de E-Cad tras el tratamiento con AuNP. Es bien sabido que la baja regulación de la expresión de E-Cad es el sello distintivo de la plasticidad epitelial ( 9 , 41 ). Nuestros datos demostraron que el tratamiento con AuNP resultó en un aumento sustancial en la expresión de E-Cad con disminución simultánea de la expresión de Vimentin , Snail y N -Cad en células de cáncer de ovario, lo que respalda aún más la función anti-EMT de AuNP no modificados ( Fig. 2 G ). Además, estudios previos demostraron que en las células epiteliales E-Cad se localiza predominantemente en la membrana plasmática, mientras que en las células mesenquimatosas se localiza principalmente en la región perinuclear ( 27 - 29 ). Nuestros datos mostraron que el tratamiento con AuNP produjo un cambio en la localización de E-Cad de un sitio más perinuclear a la membrana celular, lo que respalda aún más la inversión de EMT después del tratamiento con nanopartículas ( Fig. 2 H ) ( 42- 44 ). Dado que se reconoce que EMT confiere resistencia a los medicamentos y potencial metastásico a las células cancerosas ( 11 - 13 ), los AuNP pueden encontrar amplias aplicaciones para sensibilizar las células cancerosas resistentes a los medicamentos a los quimioterapéuticos y para prevenir la metástasis.
Mediante el uso de modelos ortotópicos humanos de cáncer de ovario, podemos evaluar la propiedad antitumoral y antimetastásica de AuNP. El tratamiento con AuNP inhibió significativamente el crecimiento tumoral primario en el modelo A2780 ( Fig. 3 ), en donde redujo significativamente el crecimiento tumoral y la formación de nódulos metastásicos en los modelos SKOV3-ip ( Fig. 4 ). Se ha hecho evidente que las vías de desarrollo de EOC son distintas, creando respuestas variables a las estrategias terapéuticas ( 15 ). La evaluación de la histología de los xenoinjertos tumorales en el modelo A2780 produjo una reducción significativa de las células tumorales en proliferación, como lo demuestra la tinción de Ki67 tras el tratamiento con AuNP de 20 nm ( Fig. 3 E ) Además, la tinción de CD31 de los tejidos tumorales tratados con AuNP también demostró una reducción en el número de vasos sanguíneos tumorales en comparación con los tejidos no tratados lo que es consistente con el efecto inhibidor de los AuNP hacia HB – GF ( Fig. 3 F y G ) ( 45 - 47 ). Además, la reversión de EMT mediada por AuNP y la abrogación de la activación de MAPK que conduce a la inhibición del crecimiento tumoral y la metástasis se confirmó adicionalmente mediante análisis de tejidos tumorales mediante análisis de transferencia Western ( Fig. 4 D ). El análisis de transferencia Western reveló claramente un aumento en la expresión de E-Cad y una disminución en p42 / 44-fosfo y Snail en tejidos tumorales tratados con AuNP, confirmando la propiedad antimetastásica de AuNP no modificado a través de la reversión de EMT.
Aunque los principales esfuerzos en nanotecnología biomédica se han concentrado en la entrega de fármacos y aplicaciones de biodetección, la caracterización biológica de las nanopartículas no modificadas sigue siendo poco investigada. La capacidad de una sola nanopartícula autoterapéutica de oro para derogar las cascadas de señalización de múltiples factores de crecimiento (GFs) es distintiva y pretende una posible aplicación médica. Al anular la señalización de MAPK y prevenir la plasticidad epitelial (EMT), las nanopartículas de oro (AuNP) no modificados inhiben el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos preclínicos de cáncer de ovario. Nuestros hallazgos presentan una función biológica única de nanopartículas no modificadas y allanan el camino para futuras investigaciones sobre el uso de nanopartículas inorgánicas como una clase de agentes antitumorales y antimetastásicos.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud Grant CA135011 y CA136494 (a PM) y CA157481 (a RB).
MATERIAL SUPLEMENTARIO
Este artículo contiene información de respaldo en línea en www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1214547110/-/DCSupplemental .
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Articulo traducido al Español por Horux Lab® y publicado por PubMed Central® (PMC) que es un archivo de revistas biomédicas y de ciencias biológicas en la Biblioteca Nacional de Medicina de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (NIH / NLM). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3637766/
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