El óxido de grafeno se dirige selectivamente a las células madre del cáncer
A través de múltiples tipos de tumores: implicaciones para el tratamiento del cáncer no tóxico, a través de "nanoterapia basada en la diferenciación".
RESUMEN DEL ESTUDIO
Las células iniciadoras de tumores (TIC), también conocidas como células madre cancerosas (CSC), son difíciles de erradicar con los enfoques convencionales para el tratamiento del cáncer, como la quimioterapia y la radiación. Como consecuencia, se cree que la supervivencia de las CSC residuales impulsa la aparición de recurrencia tumoral, metástasis a distancia y resistencia a los medicamentos, que es un problema clínico significativo para el tratamiento eficaz del cáncer. Por lo tanto, se necesitan enfoques novedosos para la terapia del cáncer con urgencia, para abordar esta necesidad clínica. Con este fin, aquí hemos investigado el potencial terapéutico del óxido de grafeno para atacar las células madre del cáncer. El grafeno y sus derivados son nano-materiales bien conocidos, relativamente inertes y potencialmente no tóxicos que forman dispersiones estables en una variedad de solventes. Aquí, Demostramos que el óxido de grafeno (de copos grandes y pequeños) puede usarse para inhibir selectivamente la expansión proliferativa de células madre cancerosas, a través de múltiples tipos de tumores. Para este propósito, empleamos el ensayo de la esfera tumoral, que mide funcionalmente la expansión clonal de células madre cancerosas individuales en condiciones independientes del anclaje. Más específicamente, mostramos que el óxido de grafeno inhibe eficazmente la formación de esferas tumorales en múltiples líneas celulares, en 6 tipos diferentes de cáncer, incluidos los cánceres de mama, ovario, próstata, pulmón y páncreas, así como el glioblastoma (cerebro). En contraste sorprendente, el óxido de grafeno no es tóxico para las células cancerosas "masivas" (no madre) y los fibroblastos normales. Mecánicamente, presentamos evidencia de que GO ejerce sus sorprendentes efectos sobre las CSC al inhibir varias vías clave de transducción de señales (WNT, Notch y señalización STAT) y, por lo tanto, inducir la diferenciación CSC. Por lo tanto, el óxido de grafeno puede ser una estrategia terapéutica no tóxica efectiva para la erradicación de las células madre del cáncer, a través de la nanoterapia basada en la diferenciación.
INTRODUCCIÓN
Las células madre cancerosas (CSC) son resistentes a los enfoques terapéuticos convencionales [ 1 - 3 ]. Como consecuencia, se han implicado directamente en la patogenia de la enfermedad de recurrencia tumoral y metástasis a distancia [ 4 , 5 ]. Además, las CSC resistentes a los medicamentos se han relacionado con resultados clínicos desfavorables, en diferentes tipos de tumores [ 6 - 8 ]. Como solo un porcentaje muy pequeño de las células cancerosas tienen propiedades "parecidas al tallo" e "iniciadoras de tumores", son difíciles de estudiar y sus características distintivas clave permanecen relativamente sin caracterizar, aunque parecen resistir tanto la quimioterapia como la radiación.
Curiosamente, las CSC comparten muchas propiedades con las células madre normales, incluida la inmortalidad y la resistencia al estrés, así como la división celular asimétrica [ 9 , 10 ]. Una característica distintiva particular de las CSC es su capacidad para iniciar tumores y experimentar un crecimiento independiente del anclaje, cuando se cultivan en suspensión [ 11 ]. En estas condiciones particulares de cultivo celular, las CSC proliferan y forman estructuras similares a esferoides 3D, que contienen CSC y células progenitoras, que se conocen como "esferas tumorales" u "onco-esferas" [ 12 , 13] En contraste, la gran mayoría de los no CSC se someten a una forma especializada de apoptosis en cultivos en suspensión, llamada anoikis. Es importante destacar que cada esferoide 3D se origina a partir de la proliferación clonal de un único CSC, no se debe a la autoagregación de las células cancerosas. Por lo tanto, la formación de la esfera tumoral es un medio eficiente para enriquecer selectivamente las CSC. La población de CSC es resistente al daño en el ADN y también muestra niveles más bajos de producción de ROS [ 14 , 15 ]. Las esferas tumorales 3D derivadas de las células de cáncer de mama también se conocen como esferas de mamografía [ 12 , 13 ].
Clínicamente, existe una necesidad urgente de identificar nuevas estrategias terapéuticas para dirigirse selectivamente a las CSC. Aquí, mostramos que el óxido de grafeno (GO) demuestra esta selectividad. Como tal, nuestro estudio actual proporciona una nueva razón para explotar el óxido de grafeno en sí mismo como un agente terapéutico contra el cáncer, en lugar de simplemente como un agente de administración de fármacos [ 16 ].
RESULTADOS
Las escamas GO atacan a las células madre del cáncer de mama
Aquí, probamos la eficacia del óxido de grafeno como un nuevo agente potencial contra el cáncer, para la selección selectiva de CSC. El grafeno, descrito como láminas bidimensionales de átomos de carbono sin ningún grupo funcional adicional, no forma dispersiones estables en agua u otros solventes biológicamente relevantes [ 17 ]. Por otro lado, el óxido de grafeno [ 18 ] es el derivado de grafeno soluble en agua que se puede producir con varios tamaños y con grupos funcionales variados y que se puede manipular más fácilmente experimentalmente, especialmente en sistemas biológicos. Las dispersiones GO estériles se prepararon en una mezcla al 5% de DMSO en agua doblemente destilada para estos estudios.
Inicialmente, probamos la capacidad de GO para afectar la proliferación de CSC, utilizando células MCF7, una línea celular de cáncer de mama ER (+) bien establecida. Se utilizaron dos grados de GO, GO pequeño (s-GO) con tamaños de copos de 0.2–2 μm y GO grande (b-GO) con tamaños de copos de 5–20 μm, para representar dos clases de tamaños, donde los copos son menor o mayor que las células diana (Figura 1). Para este propósito, evaluamos los efectos del óxido de grafeno en la expansión clonal independiente del anclaje de las CSC MCF7, usando el ensayo de la esfera tumoral. Este ensayo funcional mide directamente la expansión proliferativa de CSC [ 12 ]. Figura 2 muestra los resultados de este análisis. Usando copos s-GO, observamos una inhibición dependiente de la dosis de la formación de la esfera tumoral, en el rango de 1.25 a 25 μg / ml, con un IC-50 de ~ 12.5 μg / ml. De manera similar, al usar escamas de b-GO, también observamos una inhibición dependiente de la dosis de la formación de la esfera tumoral, en el rango de 6.25 a 100 μg / ml, nuevamente con un IC-50 de ~ 12.5 μg / ml. Es importante destacar que, tanto pequeñas como grandes copos GO no afectaron la viabilidad de la población mayor no CSC de las células MCF7, lo que indica selectividad hacia células madre cancerosas (Figura 2).
Los copos GO se dirigen a las CSC en múltiples tipos de cáncer
Dado que tanto los copos GO pequeños como los grandes mostraron una potencia similar, nos centramos más en evaluar la eficacia de los copos b-GO. Seguidamente, evaluamos si GO también mostró una eficacia contra células madre cancerosas de varios tipos de cáncer, tales como de ovario, de próstata, de páncreas y de pulmón, así como glioblastoma (cerebro) (las seis líneas celulares sometidas a prueba se resumen en la Tabla 1. Para simplificar, probamos los copos de b-GO en dos dosis, a saber, 25 y 50 μg / ml.
Figura 3 muestra que b-GO copos también la formación de tumores-esfera inhibió eficazmente en estas otras 5 líneas celulares. Por lo tanto, nuestros resultados indican que GO debe estar dirigido a una propiedad fenotípica relativamente específica y altamente conservada de las CSC, en múltiples tipos de cáncer. Imágenes representativas de inhibición del tumor-esfera por tratamiento GO se muestran en la Figura 4 . Curiosamente, la viabilidad de mayor no CSC de estas líneas celulares de cinco cáncer (SKOV3, PC3, A549, Mia PaCa2, y U-87) no fue afectada por GO (Figura 5), destacando aún más su especificidad y selectividad para CSCs.
Es importante destacar que, b-GO copos también no afectaron la viabilidad de una línea celular de fibroblastos de piel normal (hTERT-BJ1), indicando que GO es relativamente no tóxico para las células normales del cuerpo (Figura 6). Esto es consistente con los hallazgos de muchos otros laboratorios, es decir, que GO no es tóxico para múltiples tipos de células normales [ 19 , 20 ].
Estudios mecanicistas basados en GO: efectos sobre vías de señalización CSC bien establecidas
Para obtener información mecanicista sobre cómo las escamas GO atacan a las células madre del cáncer, luego analizamos sus efectos en una serie de vías de transducción de señales bien establecidas, que se ha demostrado que contribuyen a la "potencia" [ 21 - 23 ].
Para este propósito, utilizamos un panel de líneas celulares MCF7 que se transfectaron de manera estable con diferentes reporteros de luciferasa, que permite medir cuantitativamente el estado de activación de una ruta de transducción de señal dada. Curiosamente, la Figura 7 muestra que un número de vías de señalización se inhibieron significativamente por el tratamiento GO. Más específicamente, el tratamiento con GO inhibió la señalización impulsada por WNT y Notch, así como la señalización STAT1 / 3 y la respuesta antioxidante dependiente de NRF2. Sin embargo, se observó poco o ningún efecto sobre TGF-beta / Smad-señalización (Figura 7).
Por lo tanto, parece que el tratamiento GO de alguna manera se dirige a varias vías de transducción de señales diferentes en las células cancerosas, para reducir la "potencia" general.
GO promueve la diferenciación de las células madre del cáncer de seno
Para validar aún más la idea de que GO redujera la potencia en las CSC derivadas de MCF7, utilizamos una serie de marcadores bien establecidos de células madre de cáncer de mama (CD44 y CD24) y analizamos cuantitativamente su expresión mediante análisis FACS. Los resultados de estos estudios se presentan en la Figura 8.
Brevemente, las células MCF7 se trataron como cultivos en monocapa con GO (50 μg / ml) durante 48 horas o se dejaron sin tratar (control de vehículo solo). Luego, las células se tripsinizaron y se colocaron en placas de baja fijación durante 10 horas para inducir anoikis y enriquecer las CSC. Luego, las células individuales se analizaron mediante FACS para cuantificar la población CD44 (+) CD24- / baja, que representa las CSC de mama. Como se predijo, la CD44 (+) CD24- / baja población se enriquece en gran medida después de 10 horas en condiciones de baja fijación (vehículo solo control) (Figura 8A).
Curiosamente, GO no reduce el número total de células anoikis-resistentes (datos no presentados), pero en vez induce la expresión de CD24, lo que reduce significativamente el CD44 (+) CD24- / baja población (Figura 8B). Esto sugiere que GO inhibe la formación de la mamosfera al promover la diferenciación de las células madre del cáncer de mama, lo que respalda nuestros resultados del análisis de múltiples vías de transducción de señales.
DISCUSIÓN
Aquí, mostramos que el tratamiento con GO es suficiente para inhibir la formación de la esfera tumoral en seis líneas celulares de cáncer independientes, a través de múltiples tipos de tumores (de mama, ovario, próstata, pulmón y cáncer pancreático, así como el glioblastoma (cáncer de cerebro). Estos resultados sugieren que GO se dirige específicamente a una propiedad fenotípica global de las CSC que está altamente conservada en múltiples tipos de tumores. Además, al utilizar células MCF7 que expresan un panel de reporteros de luciferasa, observamos que el tratamiento con GO fue suficiente para inhibir varias vías de transducción de señales diferentes, incluidas WNT, Notch, STAT1 / 3 y NRF-2, pero no afectó a TGB-beta / Señalización SMAD. Finalmente, utilizando un panel de marcadores específicos de CSC de mama bien establecidos (a saber, CD44 y CD24), mostramos que GO parece reducir el número de CSC al inducir su diferenciación, ya que ahora comienzan a expresar CD24. Por lo tanto, GO puede reducir el número de CSC de buena fe que son capaces de formar esferas tumorales, induciendo su diferenciación e inhibiendo su proliferación. Sin embargo, estudios mecanicistas adicionales están claramente justificados.
Es importante destacar que nuestros resultados preliminares indican que el tratamiento con GO no afecta significativamente el metabolismo mitocondrial oxidativo (OXPHOS) en este contexto (datos no mostrados), lo que sugiere que GO no se dirige a las mitocondrias. Esto está en contraste con nuestros estudios previos en los que una serie de antibióticos aprobados por la FDA con objetivos mitocondriales eliminan eficazmente las CSC [ 24 ]. Por lo tanto, los antibióticos GO y los dirigidos a mitocondrias parecen funcionar de manera diferente, a través de mecanismos moleculares separados y distintos.
Además, dado que los copos de b-GO tienen un tamaño de 5 a 20 μm, deben ejercer sus efectos en la superficie celular, ya que son demasiado grandes para ser internalizados dentro de las células y en realidad son más grandes que una sola célula. Esto es consistente con nuestros hallazgos de que el tratamiento con GO amortigua la activación de varias vías de transducción de señales asociadas con células madre, que se inician en la superficie celular. Esto entonces podría inducir mecánicamente CSC diferenciación, lo que hemos observado experimentalmente (que se resumen en la Figura 9).
Estudios anteriores han demostrado que GO (o sus derivados relacionados) pueden inhibir la migración de células cancerosas "a granel" o prevenir el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto [ 25 - 28 ]. Sin embargo, ninguno de estos estudios relacionó el tratamiento con GO con el fenotipo CSC o indicó que podría usarse para la terapia de "diferenciación".
Curiosamente, varios estudios han demostrado que GO no es tóxico para las células madre normales y, de hecho, GO promueve su diferenciación. Más específicamente, se demostró que el cultivo de células madre pluripotentes normales en GO como sustrato induce su diferenciación terminal hacia múltiples linajes celulares, incluidas neuronas, condrocitos y adipocitos [ 29 - 33 ]. Actualmente, estas propiedades se están explotando activamente para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, utilizando GO como un andamio para la reconstrucción ósea y la regeneración neural.
Nuestros nuevos estudios mecanicistas sugieren que GO podría usarse directamente como un agente terapéutico para atacar a las CSC, posiblemente como un agente de diferenciación. En este contexto, imaginamos que GO podría administrarse por vía intravenosa o por vía oral, como un nuevo agente terapéutico contra el cáncer, dependiendo de la ubicación del tumor. Alternativamente, los copos GO también podrían usarse como una solución de lavado durante la cirugía, para limpiar el sitio de escisión tumoral o la cavidad peritoneal (como en los cánceres de ovario u otros cánceres peritoneales) de CSC residuales, con el objetivo de prevenir la recurrencia del tumor y la metástasis a distancia. Nanoterapia basada en la diferenciación (Figura 9).
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Las líneas celulares de cáncer se compraron de ATCC u otras fuentes disponibles comercialmente. El medio de cultivo celular de la marca Gibco (DMEM / F12) se adquirió de Life Technologies.
Óxido de grafeno
El óxido de grafeno se preparó utilizando el método Hummers con modificaciones [ 34 , 35] Las escamas de óxido de grafito individuales contienen grupos carboxilo principalmente en los bordes, y grupos epóxido, hidróxido y cetona principalmente en el plano basal. La relación C a O suele ser ligeramente inferior o superior a 1, según lo determinado por la espectroscopía de fotoemisión de rayos X. Las escamas de óxido de grafeno de diferentes tamaños se separaron centrifugando suspensiones de óxido de grafeno a varias rpm y recogiendo diferentes fases de la suspensión. La caracterización AFM de las escamas de óxido de grafeno se realizó en un sistema AFM Bruker Dimension FastScan utilizando el modo de grabación. Los sustratos se prepararon mediante moldeo por rotación de la suspensión sobre un sustrato de Si / SiO2 para producir una película de monocapa, seguido de imágenes de AFM. Las concentraciones se obtuvieron a partir de espectros UV-Vis, que se registraron en celdas de cuarzo de 10 mm de longitud de trayectoria utilizando un espectrómetro PerkinElmer Lambda - 1050 UV-Vis-NIR. Las dispersiones se diluyeron para dar una intensidad de absorción inferior a 1.
Cultura de la esfera tumoral
Se preparó una suspensión de células individuales usando enzimático (1x Trypsin-EDTA, Sigma Aldrich, # T3924) y desagregación manual (aguja de calibre 25) para crear una suspensión de células individuales. Las células se sembraron en una densidad de 500 células / cm 2 en medio mammosphere (DMEM-F12 / B27 / 20 ng / ml EGF / PenStrep) en condiciones no adherentes, en placas de cultivo recubiertas con (2-hidroxietilo) (poli-HEMA, Sigma, # P3932) [ 12 ]. Las células se cultivaron durante 5 días y se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 ° C a una presión atmosférica en 5% (v / v) de dióxido de carbono / aire. Después de 5 días para el cultivo, se contaron las esferas> 50 μm utilizando una retícula ocular, y el porcentaje de formación de la esfera tumoral se normalizó al 100% para el control del vehículo solo (1 = 100% TSF) [ 12] Todos los experimentos se realizaron por triplicado, tres veces de forma independiente, de modo que cada punto de datos representa el promedio de 9 repeticiones.
Evaluación de vías de señalización CSC
Se eligió el sistema de ensayo de indicador de Cignal Lenti (luc) (Qiagen) para controlar la actividad de varias rutas de transducción de señales en células MCF7. Las construcciones de luciferasa receptivas codifican el gen informador de luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor CMV mínimo (m) y repeticiones en tándem de elementos de respuesta para cada vía. Se utilizaron las siguientes construcciones: TCF / LEF (luc) para la transducción de señales Wnt (CLS-018L); STAT3 (luc) para la actividad transcripcional de STAT3 (CLS-6028L); RBP-Jk (luc) para señalización inducida por Notch (CLS-014L); ARE (luc) para la respuesta antioxidante mediada por Nrf2 y Nrf1 (CLS-2020L); GAS (luc) para la transducción de señal Stat1 inducida por interferón gamma (CLS-009L); SMAD (luc) para la transducción de señal inducida por TGFβ (CLS-017L). Brevemente, 1 × 10 5Las células MCF7-GFP se sembraron en placas de 12 pocillos. Una vez que se unieron las células, las partículas virales se diluyeron 1:10 en medios de cultivo completos que contenían polibreno (sc-134220, Santa Cruz) y se añadieron a las células. El tratamiento con puromicina (P9620, Sigma) se inició 48 horas después para seleccionar células infectadas de forma estable.
Ensayos de luciferasa
El sistema de ensayo de luciferasa (E1501, kit Promega) se utilizó en todas las células MCF7 informadoras de luciferasa tratadas con GO. En resumen, se sembraron 6 x 10 ^ { 3} células MCF7 - GFP en placas de 96 pocillos de pared negra y luego se trataron con GO (50 µg / ml). Como controles, las células tratadas con vehículo se corrieron en paralelo. Se utilizaron cuatro réplicas para cada condición. Después de 48 horas de tratamiento, se realizaron ensayos de luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La señal de luz se adquirió durante 2 minutos en fotones / segundo en la Xinagen VivoVision IVIS Lumina (Caliper Life Sciences), y los resultados se analizaron usando el software Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences). La luminiscencia se normalizó utilizando SRB (para determinar la proteína celular total), como una medida de la viabilidad celular MCF7.
Análisis de diferenciación de Anoikis y CSC
Después del tratamiento con GO, la población de CSC se enriqueció sembrando en placas de baja fijación. En estas condiciones, los no CSC se someten a anoikis (una forma de apoptosis inducida por la falta de unión adecuada) y se cree que los CSC sobreviven. La expresión de marcadores de diferenciación por la "fracción CSC" sobreviviente se analizó mediante análisis FACS. Brevemente, 1 × 10 4Las células MCF7 se trataron con GO (50 μg / ml) durante 48 h en placas de 6 pocillos, cultivadas como una monocapa. Luego, las células monocapa se tripsinizaron y se sembraron en placas de baja fijación en medios de mamosfera. Después de 10 h en condiciones de baja fijación, las células MCF7 se centrifugaron e incubaron con anticuerpos CD24 (IOTest CD24-PE, Beckman Coulter) y CD44 (ratón APC Anti-Human CD44, BD Pharmingen cat.559942) durante 15 minutos en hielo. Las células se enjuagaron dos veces y se incubaron con colorante VIVO / MUERTO (colorante reactivo violeta muerto reparable; Invitrogen) durante 10 minutos. Las muestras fueron analizadas por FACS (Fortessa, BD Bioscence). Solo se analizó la expresión de CD24 / CD44 en la población viva, identificada por la tinción de colorante LIVE / DEAD. Los datos se analizaron con el software FlowJo. También se obtuvieron resultados prácticamente idénticos usando 7-AAD (7-Aminoactinomicina D.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a la Universidad de Manchester por proporcionar fondos iniciales que contribuyeron al éxito de este estudio (a Federica Sotgia y Michael P. Lisanti). Aravind Vijayaraghavan, Maria Iliut y Andrea F. Verre recibieron el apoyo de las subvenciones EP / G03737X / 1 y EP / G035954 / 1 del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC).
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